Il Museo Pontificio Santa Casa è situato nei piani superiori del braccio occidentale del Palazzo Apostolico, che si apre davanti alla facciata della Basilica con due lati, uno più lungo a nord e l'altro più breve a ovest, caratterizzato da un imponente porticato e da un loggiato soprastante realizzato in pietra bianca d'Istria, che spicca sul partito murario di cortina laterizia.
L'ideazione del Palazzo si deve all'architetto pontificio Donato Bramante, inviato da Giulio II nel 1507 con l'incarico di "disegnare molte opere" e prevedeva tre ali porticate intorno alla piazza, la classica agorà, con funzione di fortezza, ospizio, abitazione, progetto poi modificato da Antonio da Sangallo il Giovane che dal 1517 inizia a collaborare alla costruzione della fabbrica.
I primi lavori furono diretti da Giancristoforo Romano (1511-1512), quindi affidati da Leone X ad Andrea Contucci detto il Sansovino (1512-1517), proseguiti da Cristoforo Resse da Imola e dallo stesso Sangallo. L'opera si protrasse, con alcune sospensioni, per lungo tempo: solo nel 1559 fu costruito l'ultimo pilastro del primo ordine del portico. A partire dal 1564 iniziano i lavori del porticato superiore del braccio nord ad opera dell'architetto Giovanni Boccalini (1555-1580), esecutore fedele del progetto del Sangallo, che eresse il loggiato con i pilastri ionici, le solenni balaustrate sui gradini, i portali.
L'ala occidentale del Palazzo, dove si trova il Museo Pontificio, fu iniziata in quegli anni, come suggerisce la data “1579” posta sul cordolo del basamento e nel primo ventennio del '600 risultava completato il primo loggiato e quello superiore fino ai doppi pilastri. Nel sec. XVIII Luigi Vanvitelli disegnò la balaustrata di coronamento del Palazzo e la parte decorativa del lato occidentale, oltre il completamento di alcune parti murarie, che furono realizzate tra il 1749 e il 1750 dal suo collaboratore Pietro Bernasconi.
Il Museo Pontificio Santa Casa si snoda negli ambienti del Primo piano, o Piano nobile, un tempo adibiti a foresteria, componevano cioè un appartamento riservato dal governatore della Santa Casa ad accogliere e ospitare nobili, cardinali o principi in visita al Santuario e utilizzato durante il Regno d'Italia per dare udienza ad autorità politiche e amministrative.
Le raccolte del Museo iniziano a formarsi alla fine del secolo XIX, in coincidenza con i lavori di restauro generale, sia strutturale che decorativo, operato dall'architetto Giuseppe Sacconi all'interno del Santuario, finalizzato a riportare il tempio lauretano alla sua forma originaria, con la conseguente rimozione o cancellazione di quanto era stato realizzato nel Cinquecento.
Vengono adunati e raccolti nelle Sale dipinti, arredi, oggetti d'arte provenienti in gran parte dalla Basilica e dal Palazzo Apostolico, oltre alcuni affreschi staccati dalla decorazione della cupola realizzata da Cristoforo Roncalli detto il Pomarancio negli anni 1610-1614. Già nel 1853 avevano trovato collocazione in una sala del Palazzo le tele di Lorenzo Lotto disposte sopra gli stalli dei canonici nella Cappella del Coro, attuale Cappella Spagnola, che si uniscono al Cristo e l'Adultera, sottratta nel 1797 dalle truppe napoleoniche e recuperata nel 1824, che ornava una delle sale dell'Appartamento dei Principi, come era chiamato l'antico Appartamento Nobile, che mostrava fin dal 1783, sulle pareti di uno dei saloni di ricevimento, gli Arazzi raffaelleschi donati al Santuario lauretano nel 1667 dal nobile genovese Giovanni Battista di Niccolò Pallavicino.
Al fine di una migliore tutela e conservazione, nel 1870, viene rimossa dall'antica Spezieria della Santa Casa la raccolta di Maioliche urbinati dei Fontana, cui segue quella dei Patanazzi. Ad esse si aggiungono nel tempo varie donazioni e nuove opere acquisite presso antiquari o collezionisti privati nonché gli oggetti di oreficeria o di pietà popolare, di maggior pregio artistico, un tempo custoditi o esposti nella Sala del Tesoro del Santuario, che erano scampati alla requisizione napoleonica del 1797 e al successivo furto del 1974.